SDS-PEGA聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题及分析

如何防止聚丙烯酰胺垂直电泳漏胶现象已成为实验室研究人员比较头疼的问题！
　　1.  固定玻璃板时，先将厚薄玻璃板在桌面对齐后在垂直面上稍微向厚板倾斜20度，使底面薄板略高于厚板。
　　2. 将固定好的玻板固定于放有海绵垫的制胶架上，固定时用手稍用力往下压，此时封闭的灌胶系统准备完毕。
　　3.  除了以上安装技巧外，由于海绵橡胶垫用久后会老化或者损坏，从而导致漏胶的现象时常发生，建议用户可以购买粘性高柔软性好的橡胶垫。

　　常见问题及分析
　　1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？
　　在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
　　所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
　　2. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？
　　聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；
　　制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
　　3.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？
　　主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。
　　处理办法：待其充分凝固再作后续实验。
　　4. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？
　　主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
　　处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

　　5. 为什么带出现拖尾现象？
　　主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
　　处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
　　6. 为什么带出现纹理现象？
　　主要是样品不溶性颗粒引起的。
　　处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。